所需的CY3-NHS酯的量取决于待标记蛋白的量，以及CY3-NHS的比较好摩尔比为10。示例：假设所需的标记蛋白为500μL2mg/mLIgG(MW=150,000)，用100μLDMSO溶解1mgCY3-NHS酯，得到所需的CY3-NHS酯体积为5.05μL，详细计算过程如下：1)mmol(IgG)=mg/mL(IgG)×mL(IgG)/MW(IgG)=2mg/mL×0.5mL/150，000mg/mmol=6.7×10-6mmol2)mmol(CY3-NHS酯)=mmol(IgG)×10=6.7×10-6mmol×10=6.7×10-5mmol3)uL(CY3-NHS酯)=mmol(CY3-NHS酯)×MW(CY3-NHS酯)/mg/μL(CY3-NHS酯)=6.7×10-5mmol×753.88mg/mmol/0.01mg/μL=5.05μL(CY3-NHS酯)4.运行偶联反应1)将室温新鲜制备的10mg/mLCY3-NHS酯缓慢加入到0.5mL蛋白质样品中于溶液中，轻轻摇动混匀，然后短暂离心，将样品收集于反应管底部。请勿混匀，否则2)将反应管安置避光处，在接下来的间隔轻轻蛋白水解60分钟。10-15分钟，轻轻翻转几次以充分混合5.偶联偶联物以下方案是使用SepHadexG-25柱封闭染料-偶联偶联物的范例。1)根据制造说明准备SepHadexG-25柱。2)将反应混合物(来自“Runconjugationreaction”)加载到SepHadexG-25柱的顶部。3)一旦样品在顶部树脂表面下方运行，立即添加PBS(pH7.2-7.4)。4)向所需样品添加更多PBS(pH7.2-7.4)即可完成柱密封。D-荧光素钾盐小动物成像。广东荧光染料IR825
三、细胞实验D-荧光素钾盐体外生物发光试验：D-荧光素钾盐，无菌纯水，完全培养基（自行配制）1、贴壁细胞：将细胞接种于培养板中孵育数小时或过夜，使细胞贴壁。悬浮细胞：可以将细胞接种于培养板后直接进行后续操作，无需孵育。如果倍增时间相对较短，则应考虑倍增时间进行细胞计数。2、将15mg荧光素钾盐溶解于1ml无菌水中，制备成100X荧光素储备液（15mg/ml），轻轻颠倒摇动至荧光素钾盐完全溶解。混匀后立即使用或分装后-20℃冻存。3、用预热好的细胞培养基1∶100稀释100X荧光素储备液（15mg/ml），配制成荧光素工作液（终浓度150μg/ml），即配即用。4、去除培养板中的培养基。5、在成像前，将适量荧光素工作液加入细胞中，然后进行图像分析。注意：成像前在37℃下对细胞进行短时间孵育可增强信号。孵育时间取决于特定的细胞类型。一般来说孵育10分钟就足够了，根据需要进行测试和调整。6、每隔10分钟，**多40分钟，使用VILBERFUSIONFX成像系统检查体外生物发光，确定动力学曲线并找出细胞的峰值成像时间点广东荧光染料IR825Cy3 (Cyanine 3) 是一种发橘黄色荧光的花青素荧光染料。
小动物***成像技术（invivoimagingtechnology）是利用高灵敏度的光学检测仪器直接检测动物***体内的细胞活动和基因行为研究的一类技术，是近年来发展**快的生命科学研究方法，是**直接观察细胞和分子在体内行为的新兴技术，已广泛应用于生命科学研究的各个领域[1]。***动物体内光学成像主要采用生物发光与荧光发光两种技术。生物发光是利用荧光素酶报告基因在***内表达产生的荧光蛋白与体外注射的荧光素底物发生化学反映产生荧光。而荧光发光成像技术是将荧光物质或荧光物质标记的小分子物质如基因、细胞也可是小分子药物、抗体、纳米材料等导入到***体内，通过小动物***成像系统的激发光源激发荧光集团到达高能量状态，而后产生波长较激发光长的发射光，然后通过高灵敏度制冷CCD镜头探测到***内的发射光。通过***成像技术可以观测***动物体内**的生长和转移、炎症的发生、特定基因的表达和药物作用效果等生物学过程。
二、***成像分析：D-荧光素，钾盐，D-PBS,不含钙、镁1、配制溶液使用无菌D-PBS（w/oCa2+;Mg2+）配制D-荧光素钾盐溶液（15mg/ml），0.22µm滤膜过滤除菌（避光），分装后于-20℃或-80℃冷冻保存，避免反复冻融。使用时4℃融化，实验前平衡至室温（避光）2、注射量取决于注射方式，具体如下：注射方式剂量静脉注射（25-27gauge针头）按10µl/g体重浓度，加入相应体积的15mg/ml荧光素工作液腹腔注射（25-27gauge针头）按10µl/g体重浓度，加入相应体积的15mg/ml荧光素工作液肌肉注射（27gauge针头）50µl，浓度为1-2mg/ml荧光素工作液鼻内注射（pipette）50µl，浓度为3mg/ml荧光素工作液3、注射入体内10-20min（待光信号达到**强稳定平台期），再进行成像分析DiD、DiR、DiO和DiI染料是最常见的细胞膜染料，它们是一族亲脂性的荧光染料，用于细胞的形态学和结构研究。
荧光染料标记蛋白或肽技术是一种常见的蛋白质体外标记技术。除了GFP等荧光蛋白的融合表达外，目标蛋白还可以通过荧光染料标记直接进行下游实验操作，如***跟踪、细胞分选等。
FITC荧光标记的原理是什么？
荧光标记所依赖的化合物称为荧光材料。荧光材料是指具有共轭双键系统化学结构的化合物。当受到紫外线或蓝紫光的照射时，它可以被刺激为刺激状态。当激发状态恢复到基本状态时，它会发出荧光。蛋白质荧光标记技术利用荧光材料的共价结合在目标分子的基团上，利用其荧光特性提供研究对象的信息。 与花青和罗丹明染料一样，荧光素也是一种有机染料。广东荧光染料IR825
Cy5.5含有一个游离胺基,可与多种官能团共轭,包括NHS酯和环氧化合物。广东荧光染料IR825
CY5.5-NHS荧光染料是一种广泛应用于生物标记和成像的荧光染料，CY5.5-NHS荧光染料具有优异的荧光性能。其激发波长约为675nm，发射波长约为695nm，位于红色光谱区域，这使得它在生物样本中具有较强的穿透力，能够深入组织内部进行标记和成像。此外，CY5.5-NHS荧光染料具有较高的荧光量子产率和光稳定性，可以在较长时间的激发下保持稳定的荧光信号，从而确保实验结果的准确性和可靠性。CY5.5-NHS荧光染料作为一种***的荧光染料，在生物科学研究领域具有广泛的应用前景。其优异的荧光性能、良好的生物相容性、***的适用范围以及易于合成和修饰的优点，使得它成为生物医学研究中不可或缺的重要工具。广东荧光染料IR825
