NLRP3免疫组化IHC

免疫荧光通透（目的是使抗体进入胞内），0.5%TritonX-100(一种去垢剂，用PBS配制)室温通透20min（针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则省略该步骤）；除了TritonX-100，也可作为通透剂，并且固定后的样品不需要通透。封闭（减少一抗和二抗与非特异位点进行结合），通透后用PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清，室温封闭30min。常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或者是羊血清。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。醛类固定的样品，在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封闭液进行封闭。早期的免疫荧光技术是将抗体与示踪物质结合，用于定位组织或细胞内的抗原物质。NLRP3免疫组化IHC

细胞免疫荧光可以观察蛋白在细胞中的定位，以及一些特殊信号分子蛋白的出核/入核的定位变化。在进行细胞免疫荧光过程中，需要用到细胞爬片，通过将爬片浸在细胞培养基内，细胞在爬片上生长，进而进行细胞的免疫荧光。实验前准备：1.胰酶;2.DMEM细胞培养基;3.细胞培养12孔板或者6孔板;4.爬片。间接免疫荧光的优点：通过增加能够与一抗结合的二抗数量进行信号放大；与直接免疫荧光相比，通过信号放大提高检测灵敏度。免疫荧光技术是一种以荧光素标记抗体来定位抗原物质的高度发达的标记免疫技术。NLRP3免疫组化IHC免疫荧光技术是一种利用荧光物质标记抗体来定位抗原的技术。

细胞免疫荧光步骤是什么呢？步骤：1. 细胞一定要贴在玻片上（较好可以放入24孔板），为后面照像打基础。细胞密度适中，大约60-75%满片即可，否则容易脱片。2. 取出细胞后用4%多聚甲醛固定15分钟，现用现配。（以下各步骤切毋使玻片干燥）3. PBS冲洗；4. 0.1%Triton作用20分钟；5. PBS冲洗；6. 10%正常血清封闭10分钟；7. 加入一抗，4度孵育过夜（找个小瓶盖将小玻片支起来，抗体就不容易溢出），还要记住“砸片”，就是抗体从较高处落到片子上，以分布均匀。抗体稀释度1：60，较常用！8. PBS冲洗4次，各5分钟；9加入荧光二抗，室温30分钟。抗体稀释度1：400，较常用！10. 90%甘油封片。也很关键阿，多封几次才有体会。12. 避光保存，或到显微镜下观察。

荧光素标记抗体的方法：方法及步骤：①抗体的准备：取适量已知球蛋白浓度之溶液，置入三角烧瓶中，加入生理盐水及碳酸盐缓冲液，使然后蛋白浓度为20mg/ml，缓冲液容量为总量的1/10，混匀，将三角烧瓶置冰槽中，电磁搅拌（速度适当以不起泡沫为宜）5～10min。②荧光素的准备：根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克蛋白加0.01mg荧光素，用分析天平准确称所取所需的异硫氰酸荧光素粉末。③结合（或称标记）：边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于三角烧瓶壁或搅拌玻棒上（大约5～10min内加完），加毕后，继续搅拌12～18h。结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右，故须及时添冰去水；亦可将结合装置安放在4℃冰箱或冰库中。免疫荧光技术可以用于研究细胞分裂和细胞周期。

免疫荧光应用范围：其应用范围极其普遍，可以测定内分泌、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肉瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。根据诊断类别，又可分为传染性疾病、内分泌、药物检测、免疫学、血型鉴定等。许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。异硫氰酸荧光素为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，较大吸收光波长为490495nm，较大发射光波长520530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。免疫荧光技术可以用于研究细胞内蛋白质的定位和表达水平。NLRP3免疫组化IHC

在实际工作中，荧光抗原技术应用较少，因此通常将其称为荧光抗体技术或免疫荧光技术。NLRP3免疫组化IHC

荧光标记二抗的选择普遍；与使用荧光素结合一抗的检测相比，成本较低。间接免疫荧光的缺点：由于需要具有两种不同物种反应性的两种抗体，因此物种交叉反应性问题增加；与直接免疫荧光相比，时间更长（操作步骤更多）。间接免疫荧光的优点：通过增加能够与一抗结合的二抗数量进行信号放大；与直接免疫荧光相比，通过信号放大提高检测灵敏度；荧光标记二抗的选择普遍；与使用荧光素结合一抗的检测相比，成本较低。间接免疫荧光的缺点：由于需要具有两种不同物种反应性的两种抗体，因此物种交叉反应性问题增加；与直接免疫荧光相比，时间更长（操作步骤更多）。NLRP3免疫组化IHC