Genovis的ImpaRATOR™ 可用于多种 O-聚糖:依那西普是一种融合蛋白,由TNF受体的胞外结构域与人IgG1的Fc部分相连。该蛋白质在Fc区域上方含有多达13个O-糖基化的Ser/Thr残基簇,使其成为一种非常难以在结构上表征的生物制药。为了证明ImpaRATOR的聚糖特异性,制备了三种具有不同聚糖组成的依那西普样品:(i)携带单唾液酸和二唾液酸化he心1结构混合物的未经处理的糖蛋白,(ii)用SialEXO处理的糖蛋白去除唾液酸并产生裸核1结构,以及(iii)用SialEXO和GalactEXO处理的糖蛋白产生单个GalNAc残基, 也称为Tn抗原。用ImpaRATOR和FabRICATOR在一锅反应中处理三个样品(图1)。作为比较,SialEXO处理的依那西普用OpeRATOR和FabRICATOR处理。将所得肽还原、烷基化并用HILIC-MS进行分析。FabRICATOR被包括在反应中,以将Fc区与大多数C端糖肽分离,以促进其表征。FucosEXO 可在 1 至 2 小时内水解糖蛋白上的末端 α1-2,3,4 。甘肃用于自动化系统的96孔板形式PNGaseF去糖基化酶瑞典Genovis
与PNGase F类似,Genvois的OmniGLYZOR用于携带N-和简单O-糖的糖蛋白的去糖基化。 OmniGLYZOR 试剂盒包括:OmniGlyZOR 微离心柱;PNGase F 冻干;RapiGest™* SF表面活性剂。除非底物蛋白变性,否则某些 N-糖基化位点很难或无法被 PNGase F 接近。在OmniGLYZOR Microspin柱上孵育后剩余的N-糖可以在变性条件下使用试剂盒中包含的PNGase F冻干和RapiGest™ SF表面活性剂通过额外的去糖基化步骤去除。使用Genovis的OpeRAT对EPO进行O-糖位点特异性消化:对于jin携带一个或几个 O-糖基化位点的简单底物蛋白,OpeRATOR 也可用于绘制中间水平的 O-糖基化位点。 甘肃用于自动化系统的96孔板形式PNGaseF去糖基化酶瑞典GenovisGalactEXO中的酶来源于Akkermansia muciniphila,并在大肠杆菌中表达。
为了研究 OglyZOR 对天然糖蛋白的活性,将该酶与依那西普、TNFR 和阿巴西普在 37°C 下有或没有 SialEXO 孵育 1 小时。当唾液酸被去除时,OglyZOR酶有效地水解了所有三种底物中的O-聚糖。Genovis的OglyZOR 酶可有效水解天然糖蛋白中的he心 1 二糖 (Gal-β1,3-GalNAc)。这使得这些酶适合在LC-MS分析之前制备样品,以鉴定其他PTM或确认氨基酸序列O-糖基化生物制药的全去糖基化:O-糖基化生物制药(如依那西普)很难表征。为了能够通过质谱法测定完整质量数,我们进行了酶促总去糖基化。N-聚糖被Genovis的PNGase F裂解,而O-聚糖可以与OglyZOR和SialEXO一起去除。。
GlycOCATCH用于纯化粘蛋白型O-糖基化蛋白和肽。它是基于无活性的Genovis的OpeRATOR®酶,该酶经过工程改造,可以高亲和力结合O-糖基化蛋白和肽。GlycOCATCH的应用包括O糖蛋白和肽的特异性富集或去除、糖组学、复杂样品的研究和生物制药的表征。1. 粘蛋白型O-糖基化蛋白和肽的特异性富集;2. 可靠 - 高亲和力结合;3. 快速且易于使用的工作流程。不需要辅助因子或特殊缓冲液。GalNAcEXO中的酶来源于Akkermansia muciniphila,在大肠杆菌中表达,带有His标签,分子量为52 kDa。1. 用于方法开发的灵活格式;2. 可以结合酶以提高效率;3. 适用于自动化工作流程; 4. 即用型 - 只需加水即可!用于水解糖蛋白上GalNAc残基的冻干酶。Genovis的GalNAcEXO冻干剂以冻干粉末的形式提供,装在2000单位的小瓶中,用于水解2mg糖蛋白上的GalNAc残基。ImpaRATOR™ 和 OpeRATOR® - 两种协同的作用:共同提供了有关聚糖组成和 O-聚糖位点的完整信息。
生成携带 O-糖的糖肽,该酶可实现 O-糖谱分析、O-糖肽图谱和位点占用测定,以及使用 MS 分析的中级方法。1.可靠O-聚糖特异性蛋白酶 – 消化丝氨酸/苏氨酸糖基化位点的 N 末端;2.稳健的消化,增强复杂生物制药的表征;3.高特异性 - 可靠的聚糖位点测定和定位。Genovis的OpeRATOR 是一种 O-聚糖特异性蛋白酶,可消化携带he心1 O-聚糖的蛋白质,糖基化(he心 1)Ser 和 Thr 残基的 N 端。OpeRATOR 来源于 Akkermansia muciniphila,并以 E 表达。大肠杆菌。该酶含有 His 标签,分子量为 42 kDa。SialEXO 来源于 Akkermansia muciniphila,并以 E 表达。大肠杆菌。SialEXO Lyophilized 中的酶也含有 His 标签,这些组分的分子量分别为 43 kDa 和 66 kDa。用于消化粘蛋白型O-糖蛋白和肽的冻干酶。Genovis的OpeRATOR 冻干剂以冻干粉末的形式提供,装在 2000 个单位的小瓶中,用于消化 2 mg O-糖基化蛋白。GalNAcEXO冻干剂以冻干粉末的形式提供,装在2000单位的小瓶中,用于水解2mg糖蛋白上的GalNAc残基。甘肃用于自动化系统的96孔板形式PNGaseF去糖基化酶瑞典Genovis
GalNAcEXO 酶来源于Akkermansia muciniphila,在大肠杆菌中表达,带有His标签,分子量为52 kDa。甘肃用于自动化系统的96孔板形式PNGaseF去糖基化酶瑞典Genovis
对Genovis的ImpaRATOR处理的样品的分析表明,ImpaRATOR很好地消化了所有三种底物并产生了相似的糖肽,但预期的聚糖种类不同。用ImpaRATOR处理的样品比其他样品含有更多的变异,因为每种肽都检测到多种聚糖结构。观察到的聚糖种类主要是单唾液酸化和二唾液酸化he心1结构,这与依那西普的预期一致。用ImpaRATOR或OpeRATOR消化的SialEXO预处理样品均产生具有裸核1结构的肽,但携带在ImpaRATOR消化样品中观察到的Tn抗原的肽T205-P207除外。依那西普用 SialEXO 和 GalactEXO 预处理,然后用 ImpaRATOR 消化,得到含有 Tn 抗原的肽。总之,这些数据证明了ImpaRATOR的高聚糖底物接受度。ImpaRATOR处理的依那西普显示出与相应的去唾液酸化OpeRATOR处理样品略有不同的消化模式。例如,OpeRATOR在两个O-糖基化氨基酸之间消化的效率比ImpaRATOR更有效。具有完整唾液酸或Tn抗原的依那西普被OpeRATOR消化得非常弱(数据未显示)。甘肃用于自动化系统的96孔板形式PNGaseF去糖基化酶瑞典Genovis
对Genovis的ImpaRATOR处理的样品的分析表明,ImpaRATOR很好地消化了所有三种底物...
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