在深度组织中以较长时间对活细胞成像，双光子显微镜是当前之选。双光子和共聚焦显微镜都是通过激光激发样品中的荧光标记，使用探测器测量被激发的荧光。但是，共聚焦一般使用单模光纤耦合激光器，通过单光子激发荧光，而双光子使用飞秒激光器，通过几乎同时吸收两个长波光子激发荧光。下面是两种技术的对比图。双光子激发荧光的主要优势：双光子比共聚焦使用的更长的波长，所以对组织的损伤更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般为100微米，双光子则能达到250到500微米，甚至超过1毫米。另外，同时吸收两个光子意味只有较强度聚焦点处能被激发，所以不会损伤焦平面之外的组织，并且生成更清晰的图像。双光子显微镜明日之星--FemtoFiber ultra 920 。ultima双光子显微镜厂家电话
双光子吸收理论早在1931年就由诺奖得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因为有了激光才得到实验验证，但是到WinfriedDenk发明双光子显微镜又用了将近30年。要理解双光子的技术挑战和飞秒激光发挥的重要作用，首先要了解其中的非线性过程。双光子吸收相当于和频产生非线性过程，这要求极高的电场强度，而电场取决于聚焦光斑大小和激光脉宽。聚焦光斑越小，脉宽越窄，双光子吸收效率越高。对于衍射极限显微镜，聚焦在样品上的光斑大小只和物镜NA和激光波长有关，所以关键变量只剩下激光脉宽。基于以上分析，能够以高重频(100MHz)输出超短脉冲(100fs量级)的飞秒激光器成了双光子显微镜的标准激发光源。这也再次说明双光子显微镜的优势：只有焦平面处才能形成双光子吸收，而焦平面之外由于光强低无法被激发，所以双光子成像更清晰。ultima双光子显微镜厂家电话如果已经有了飞秒光，就可以几套双光子显微镜共享一台，只需分光即可。
在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收两个长波长的光子，然后发射出一个波长较短的光子，其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），在单光子激发时，在波长为350nm光的激发下发出450nm荧光；而在双光子激发时，可采用700nm的激发光得到450nm荧光。由于双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，从而可以减少光漂白和光毒性带来的不利影响。
1990年初，当WinfriedDenk刚从康奈尔大学博士毕业准备前往瑞士读博后时，他看了一本关于激光扫描显微镜的书，从中了解到非线性光学效应——强光和物质的相互作用。当时，Denk有同事研究生物样品中的钙离子但苦于没有强大的紫外激光器和光学元件，于是他就想到如果使用双光子吸收就能够绕开紫外，换言之，与其通过一个紫外光子激发标记的钙离子，通过两个双倍波长的可见光光子也能激发相同的荧光。有了想法后马上实验。借了一套染料飞秒激光器，Denk联合他的导师WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六个小时就完成了实验搭建，采集数据则用了两到三天，于是一篇里程碑式的文章就此诞生了。双光子显微镜使用的是可见光或近红外光作为光源。
高光子密度带来的高能量容易损伤细胞，所以双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲达到最大值所持续的周期只有十万亿分之一秒，而其频率可以达到80至100兆赫，这样即能达到双光子激发的高光子密度要求，又能不损伤细胞，使扫描能更好地进行。双光子显微镜在各领域研究中已有许多成功实例生物领域：贝尔实验室的Svoboda等人研究了大脑皮层神经元细胞内钙离子动力学情形。利用双光子显微镜观察到的现象证明了钙离子的增加依赖于肌体触发的钠离子作用电势。信息领域：美国科学家Rentzepis提出了一种在现有二维光盘的基础上将数据储存扩展到三维空间。由于双光子激发具有作用精细体积小的特点，避免了层与层之间的互相干扰，极大地提高了数据储存密度。双光子显微镜不需要共聚焦细孔，提高了荧光检测效率。ultima双光子显微镜厂家电话
双光子显微镜在多个领域研究中已有许多成功实例。ultima双光子显微镜厂家电话
目前，世界各国的脑科学研究如火如荼，中国的脑计划也即将启动。其中，关于全景式解析脑连接图谱和功能动态图谱的研究成为重点研究方向，而如何打破尺度壁垒，融合微观神经元和神经突触活动与大脑整体的信息处理和个体行为信息，是领域内亟待解决的一个关键挑战。2021年1月6日，由北京大学分子医学研究所牵头，联合北大信息科学技术学院电子学系、工学院以及中国人民******医学科学院等组成的跨学科团队，在NatureMethods在线发表题为“Miniaturetwo-photonmicroscopyforenlargedfield-of-view,multi-plane,andlong-termbrainimaging”的文章。文中报道了第二代微型化双光子荧光显微镜FHIRM-TPM2.0，其成像视野是该团队于2017年发布的低1代微型化显微镜的7.8倍，同时具备三维成像能力，获取了小鼠在自由运动行为中大脑三维区域内上千个神经元清晰稳定的动态功能图像，并且实现了针对同一批神经元长达一个月的追踪记录。ultima双光子显微镜厂家电话
